DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統(tǒng)專業(yè)產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統(tǒng)是一套完整的多光子激光掃描熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)，采用飛秒激光脈沖多光子激發(fā)、振鏡快速掃描、非掃描檢測(cè)（NDD）以及 bh 的多維 TCSPC 技術(shù)進(jìn)行熒光壽命成像。該系統(tǒng)以優(yōu)秀的時(shí)間分辨率、優(yōu)秀的重現(xiàn)性、高空間分辨率、高靈敏度和接近出色的光子效率記錄熒光壽命圖像。對(duì)熒光壽命的檢測(cè)可低至 10 ps，衰變數(shù)據(jù)可解析為寬度低至 203 fs 的 4096 個(gè)時(shí)間通道，像素格式可增至 2048 × 2048。系統(tǒng)包含顯微鏡和激光器，同時(shí)也可作為現(xiàn)有傳統(tǒng)顯微鏡的多光子 FLIM 升級(jí)方案，并支持組合式多光子/共焦系統(tǒng)的配置。

系統(tǒng)兼容性與功能特性

DCS-120 MP 系統(tǒng)可用于尼康、蔡司和奧林巴斯的倒置顯微鏡。為了利用多光子激發(fā)的高穿透深度，該系統(tǒng)采用了非掃描檢測(cè)方式。由于其光束掃描速度快、靈敏度高，DCS-120 系統(tǒng)可用于活細(xì)胞成像。系統(tǒng)功能包括在兩個(gè)完全平行的波長(zhǎng)通道中同時(shí)記錄 FLIM 或穩(wěn)態(tài)熒光圖像、激光波長(zhǎng)復(fù)用、時(shí)間序列 FLIM、時(shí)間序列記錄、Z-Stack FLIM、磷光壽命成像（PLIM）、熒光壽命瞬時(shí)掃描（FLITS）和 FCS 記錄。應(yīng)用重點(diǎn)是熒光團(tuán)與其分子環(huán)境相互作用而產(chǎn)生的壽命變化，典型應(yīng)用包括離子濃度測(cè)量、FRET 實(shí)驗(yàn)、代謝成像、快速生理效應(yīng)成像和植物生理學(xué)。

激發(fā)源配置

DCS-120 MP 多光子熒光成像系統(tǒng)可配備鈦藍(lán)寶石激光器和飛秒光纖激光器兩種版本。鈦藍(lán)寶石激光器系統(tǒng)具有可調(diào)諧性和高激光功率的優(yōu)點(diǎn)，高功率允許使用 AOM（聲光調(diào)制器）進(jìn)行軟件控制的強(qiáng)度調(diào)節(jié)、快速光束消隱和像素同步開(kāi)/關(guān)調(diào)制，以同時(shí)進(jìn)行 FLIM/PLIM 操作。光纖激光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，易于使用，幾乎無(wú)需維護(hù)，波長(zhǎng)固定為 780 nm。大多數(shù)熒光團(tuán)的雙光子吸收帶都很寬，足以在此波長(zhǎng)下激發(fā)，且 780 nm 是激發(fā) NADH 的優(yōu)異波長(zhǎng)，因此光纖激光系統(tǒng)幾乎是出色的多光子代謝-熒光成像系統(tǒng)。激發(fā)波長(zhǎng)范圍通常從 650 nm 到 1200 nm，激光控制集成在系統(tǒng)軟件中。

系統(tǒng)原理與操作模式

系統(tǒng)基于快速振鏡激光掃描激發(fā)、非掃描檢測(cè)（NDD）和 bh 的多維 TCSPC FLIM 技術(shù)。激發(fā)采用 fs 脈沖激光，支持自由光束或光纖耦合輸入，掃描速率可低至約 1 μs/pixel。系統(tǒng)支持的操作模式涵蓋兩個(gè)（多）光譜或偏振通道、時(shí)間序列、Z-堆棧、馬賽克（X、Y、Z、時(shí)間）、激發(fā)波長(zhǎng)多路復(fù)用、FLITS（熒光壽命-瞬態(tài)掃描）、與 FLIM 同時(shí)進(jìn)行的 PLIM（磷光壽命成像）、光子相關(guān)（FCS、FCCS、門控 FCS），以及單點(diǎn)熒光和磷光衰減測(cè)量。

掃描頭與光學(xué)系統(tǒng)

掃描頭采用快速振鏡激光掃描激發(fā)光學(xué)原理，配備兩個(gè)獨(dú)立輸入，支持光纖耦合或自由光束方式。光學(xué)激光功率控制通過(guò)連續(xù) ND 濾光片輪實(shí)現(xiàn)。激光輸入要求為準(zhǔn)直自由光束，或帶 12 mm 直徑準(zhǔn)直器的光纖耦合光束，光束直徑為 1 至 2 mm。掃描頭通過(guò)適配器連接顯微鏡左側(cè)端口或頂部端口。系統(tǒng)提供兩個(gè)非掃描檢測(cè)通道，通過(guò)二向色或偏振分光鏡進(jìn)行通道分離。

掃描控制

掃描控制由硬件執(zhí)行精確激光掃描，快速回掃實(shí)現(xiàn)快速采集。幀尺寸范圍為幀掃描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行掃描 16 至 4096 像素。X 掃描支持連續(xù)掃描或逐個(gè)像素掃描，Y 掃描為逐行掃描。系統(tǒng)支持軟件控制帶有模擬調(diào)制輸入的激光器或控制單獨(dú)的 AOM。激光復(fù)用支持幀、行、像素和像素內(nèi)級(jí)別，需要軟件控制激光功率。光束消隱在飛返期間和掃描停止時(shí)執(zhí)行，同樣需要軟件控制激光功率。幀頻和掃描速度可自動(dòng)選擇最快速率或手動(dòng)選擇，并提供交互式掃描區(qū)域選擇、硬件縮放與偏移、快速預(yù)覽功能以及交互式測(cè)量點(diǎn)選擇的光束駐留功能。

TCSPC 系統(tǒng)配置

系統(tǒng)可選配兩種 TCSPC/FLIM 模塊。SP### DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統(tǒng)專業(yè)產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統(tǒng)是一套完整的多光子激光掃描熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)，采用飛秒激光脈沖多光子激發(fā)、振鏡快速掃描、非掃描檢測(cè)以及 bh 的多維 TCSPC 技術(shù)進(jìn)行熒光壽命成像。該系統(tǒng)以優(yōu)秀的時(shí)間分辨率、優(yōu)秀的重現(xiàn)性、高空間分辨率、高靈敏度和接近出色的光子效率記錄熒光壽命圖像。對(duì)熒光壽命的檢測(cè)可低至 10 ps，衰變數(shù)據(jù)可解析為寬度低至 203 fs 的 4096 個(gè)時(shí)間通道，像素格式可增至 2048 × 2048。系統(tǒng)包含顯微鏡和激光器，也可用于將現(xiàn)有的傳統(tǒng)顯微鏡轉(zhuǎn)換為全功能的多光子激光掃描顯微鏡。

系統(tǒng)配置與激光器選擇

DCS-120 MP 多光子熒光成像系統(tǒng)可配備鈦藍(lán)寶石激光器和飛秒光纖激光器兩種版本。鈦藍(lán)寶石激光器系統(tǒng)具有可調(diào)諧性和高激光功率的優(yōu)點(diǎn)，高功率允許使用 AOM（聲光調(diào)制器）進(jìn)行軟件控制的強(qiáng)度調(diào)節(jié)、快速光束消隱和像素同步開(kāi)/關(guān)調(diào)制，以同時(shí)進(jìn)行 FLIM / PLIM。光纖激光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，易于使用，幾乎無(wú)需維護(hù)，缺點(diǎn)是波長(zhǎng)固定為 780 nm。不過(guò)，大多數(shù)熒光團(tuán)的雙光子吸收帶都很寬，足以在此波長(zhǎng)下激發(fā)它們，且 780 nm 也是激發(fā) NADH 的優(yōu)異波長(zhǎng)，因此光纖激光系統(tǒng)幾乎是出色的多光子代謝-熒光成像系統(tǒng)。

為了利用多光子激發(fā)的高穿透深度，DCS-120 MP 采用了非掃描檢測(cè)。系統(tǒng)可用于尼康、蔡司和奧林巴斯的倒置顯微鏡。由于其光束掃描速度快、靈敏度高，DCS-120 系統(tǒng)可用于活細(xì)胞成像。

系統(tǒng)功能與典型應(yīng)用

DCS-120 的功能包括在兩個(gè)完全平行的波長(zhǎng)通道中同時(shí)記錄 FLIM 或穩(wěn)態(tài)熒光圖像、激光波長(zhǎng)復(fù)用、時(shí)間序列 FLIM、時(shí)間序列記錄、Z-Stack FLIM、磷光壽命成像（PLIM）、熒光壽命瞬時(shí)掃描（FLITS）和 FCS 記錄。應(yīng)用重點(diǎn)是熒光團(tuán)與其分子環(huán)境相互作用而產(chǎn)生的壽命變化，典型應(yīng)用包括離子濃度測(cè)量、FRET 實(shí)驗(yàn)、代謝成像、快速生理效應(yīng)成像和植物生理學(xué)。

系統(tǒng)原理與操作模式

系統(tǒng)基于快速振鏡激光掃描激發(fā)、非掃描檢測(cè)（NDD）和 bh 的多維 TCSPC FLIM 技術(shù)。激發(fā)采用飛秒脈沖激光器，自由光束或光纖耦合輸入，掃描速率可低至約 1 μs/pixel。系統(tǒng)支持的操作模式涵蓋兩個(gè)（多）光譜或偏振通道、時(shí)間序列、Z-堆棧、馬賽克（X、Y、Z、時(shí)間）、激發(fā)波長(zhǎng)多路復(fù)用、FLITS（熒光壽命-瞬態(tài)掃描）、與 FLIM 同時(shí)進(jìn)行的 PLIM（磷光壽命成像）、光子相關(guān)（FCS、FCCS、門控 FCS），以及單點(diǎn)熒光和磷光衰減測(cè)量。

掃描頭與光學(xué)系統(tǒng)

掃描頭采用快速振鏡激光掃描激發(fā)原理，配備兩個(gè)獨(dú)立輸入，支持光纖耦合或自由光束。光學(xué)激光功率控制通過(guò)連續(xù) ND 濾光片輪實(shí)現(xiàn)。激光輸入要求為準(zhǔn)直自由光束，或帶 12 mm 直徑準(zhǔn)直器的光纖耦合光束，光束直徑為 1 至 2 mm。掃描頭通過(guò)適配器連接顯微鏡左側(cè)端口或頂部端口。

掃描控制

掃描控制由硬件執(zhí)行精確激光掃描，快速回掃實(shí)現(xiàn)快速采集。幀尺寸范圍為幀掃描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行掃描 16 至 4096 像素。X 掃描支持連續(xù)掃描或逐個(gè)像素掃描，Y 掃描為逐行掃描。系統(tǒng)支持軟件控制帶有模擬調(diào)制輸入的激光器或控制單獨(dú)的 AOM。激光復(fù)用支持幀、行、像素和像素內(nèi)級(jí)別，需要軟件控制激光功率。光束消隱在飛返期間和掃描停止時(shí)執(zhí)行，需要軟件控制激光功率。幀頻和掃描速度可自動(dòng)選擇最快速率或手動(dòng)選擇，并提供交互式掃描區(qū)域選擇、硬件縮放與偏移、快速預(yù)覽功能以及交互式測(cè)量點(diǎn)選擇的光束駐留功能。

TCSPC 系統(tǒng)配置

系統(tǒng)可選配兩種 TCSPC/FLIM 模塊。SPC-180NX 模塊提供典型值 2 個(gè)、最多 4 個(gè)并行 TCSPC/FLIM 通道，電氣時(shí)間分辨率為 1.6 ps RMS / 3.5 ps FWHM，定時(shí)精度為 1.1 ps，最小時(shí)間通道寬度為 405 fs，飽和計(jì)數(shù)率為 12 MHz。SPC-QC-104 模塊提供典型值 2 個(gè)、最多 3 個(gè)并行通道，電氣時(shí)間分辨率為 16 ps RMS / 小于 39 ps FWHM，定時(shí)精度為 11 ps，最小時(shí)間通道寬度為 4 ps，飽和計(jì)數(shù)率為 40 MHz（活動(dòng)通道共享）。激光復(fù)用同步最多支持 4 個(gè)激光波長(zhǎng)，多波長(zhǎng)數(shù)據(jù)可通過(guò)路由功能在 16 個(gè)通道中同時(shí)記錄。實(shí)驗(yàn)觸發(fā)功能采用 TTL，用于 Z-Stack FLIM 和顯微鏡控制的時(shí)間序列。TCSPC 系統(tǒng)的操作模式包括硬件預(yù)分析成像、光子事件流（FIFO）成像、相關(guān)點(diǎn)測(cè)量與長(zhǎng)時(shí)標(biāo)強(qiáng)度（MCS）、馬賽克成像、時(shí)間序列成像、多探測(cè)器操作、激光多路復(fù)用操作、循環(huán)和重復(fù)功能以及自動(dòng)保存功能。

軟件與數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集軟件為 bh SPCM，并配備用于集成外部設(shè)備的 bh LabVIEW，掃描儀控制軟件集成在 SPCM 中。系統(tǒng)支持 Windows 10/11 64 位操作系統(tǒng)，并配備集成式電動(dòng)樣品臺(tái)。數(shù)據(jù)分析由 bh SPCImage NG 執(zhí)行，該軟件是時(shí)域分析和相位分析的結(jié)合，通過(guò)在 GPU 上運(yùn)行計(jì)算，幾秒鐘內(nèi)即可得到結(jié)果。其他功能包括通過(guò)相位圖或二維直方圖進(jìn)行圖像分割，以及系統(tǒng) IRF 自動(dòng)建模，因此無(wú)需通過(guò)記錄實(shí)際 IRF 進(jìn)行重復(fù)校準(zhǔn)。函數(shù)模型包括 IRF 卷積單、雙或三分量指數(shù)衰變、可選擇考慮不完全衰減以及偏移分量模型，采用 MLE（最大似然估計(jì)）擬合衰減曲線。

激發(fā)源與探測(cè)器選項(xiàng)

多光子 FLIM 采用自由光束或光纖耦合飛秒脈沖激光器，支持單一波長(zhǎng)或可調(diào)波長(zhǎng)配置。可選配置為共焦 FLIM，系統(tǒng)中可耦合一個(gè)額外的 BDS-SM ps 二極管激光器。

NDD 探測(cè)器直接耦合到顯微鏡后端口，可選共焦檢測(cè)器直接耦合到掃描頭。標(biāo)準(zhǔn)配置為 HPM-100-40 混合探測(cè)器，帶 GaAsP 陰極，250 至 720 nm，最適合與 ns 壽命染料一起使用。可選 HPM-100-06 檢測(cè)器，F(xiàn)WHM IRF 寬度小于 20 ps，波長(zhǎng) 220 至 650 nm，最適合用于 ps 壽命自發(fā)熒光研究。可選 HPM-100-50 檢測(cè)器，波長(zhǎng) 400 至 900 nm，最適合長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光研究。另可選配 MW-FLIM GaAsP 多波長(zhǎng)探測(cè)器。

技術(shù)原理：多光子激發(fā)與優(yōu)勢(shì)

多光子激發(fā)利用兩個(gè)或多個(gè)激發(fā)光的光子來(lái)激發(fā)一個(gè)熒光光子。使用飛秒脈沖并通過(guò)高數(shù)值孔徑顯微鏡物鏡聚焦，可實(shí)現(xiàn)高的空間和時(shí)間功率密度——脈沖持續(xù)時(shí)間為 100 fs，重復(fù)頻率為 80 MHz，通過(guò) NA = 1.3 的鏡頭聚焦，不超過(guò) 5 mW 即可獲得大多數(shù)熒光染料的明亮熒光。要獲得可見(jiàn)光區(qū)域的熒光，激光波長(zhǎng)必須在近紅外區(qū)域，鈦藍(lán)寶石激光器、OPO 和飛秒光纖激光器可用于產(chǎn)生所需的激發(fā)波長(zhǎng)。

與單光子激發(fā)相比，多光子激發(fā)具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)。首先，樣品在激發(fā)波長(zhǎng)處的吸收率較低，散射系數(shù)也低于可見(jiàn)光或紫外線波長(zhǎng)，因此雙光子激發(fā)比單光子激發(fā)更深入組織。其次，激發(fā)被限制在功率密度較高的焦點(diǎn)體積內(nèi)，在掃描系統(tǒng)中自動(dòng)意味著激發(fā)被限制在焦平面內(nèi)，無(wú)需共焦針孔來(lái)阻擋焦平面以外的光線，多光子激發(fā)本質(zhì)上提供了光學(xué)切片能力。第三，來(lái)自深焦平面的可見(jiàn)光在流出樣品的過(guò)程中會(huì)發(fā)生大量散射，但這種光無(wú)法準(zhǔn)直，因此無(wú)法聚焦到共聚焦針孔中。多光子激發(fā)不會(huì)激發(fā)焦平面外的熒光，使得檢測(cè)樣品內(nèi)部的散射光成為可能——光線可以直接從顯微鏡鏡頭后方轉(zhuǎn)向探測(cè)器，通過(guò)投射顯微鏡鏡頭的圖像，散射光子的大部分會(huì)被傳送到檢測(cè)器，這一原理被稱為非掃描探測(cè)。

與 bh TCSPC FLIM 系統(tǒng)結(jié)合使用的第四項(xiàng)優(yōu)勢(shì)是高的時(shí)間分辨率。激發(fā)脈沖具有飛秒脈沖寬度，因此 FLIM 系統(tǒng)的儀器響應(yīng)函數(shù)不會(huì)因激發(fā)脈沖而變寬。利用快速混合探測(cè)器，IRF 寬度可低至 20 ps FWHM，直接記錄超快熒光衰減現(xiàn)象的能力為 FLIM 應(yīng)用開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域。