多光子顯微鏡無需染料或熒光標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)高分辨率三維生物成像，深刻改變了生物成像領(lǐng)域。這一進(jìn)步的核心在于超短飛秒激光脈沖的運(yùn)用。此類短脈沖能夠減少光照暴露，顯著降低成像過程中的光損傷，這在活體樣本研究中尤為關(guān)鍵，使研究者在保持樣本活性的同時(shí)獲取精細(xì)圖像。
超快飛秒激光器的脈沖持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)系統(tǒng)，可在保持較低平均功率的同時(shí)提供更高的峰值功率。這種特性增強(qiáng)了成像對比度，并減少了樣品的熱暴露，對維持成像過程中生物樣本的完整性至關(guān)重要。短脈沖持續(xù)時(shí)間可將光損傷和光漂白降至較低水平，因此此類激光器適用于活細(xì)胞和組織的長期研究。
40 fs以下的亞短脈沖具備的峰值功率，對驅(qū)動(dòng)非線性光學(xué)過程必不可少，包括雙光子激發(fā)（2PE）、二次諧波產(chǎn)生（SHG）、三光子激發(fā)（3PE）和三次諧波產(chǎn)生（THG）。這些過程的信號(hào)強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的平方或立方成正比。借助這些技術(shù)，可對分子和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行精確的、無需標(biāo)記的成像。
二次諧波產(chǎn)生是一種相干非線性過程，發(fā)生在膠原纖維、微管等非中心對稱結(jié)構(gòu)及其他有序生物組裝體中，因此SHG特別適用于以較高特異性和對比度對結(jié)締組織、細(xì)胞骨架成分和纖維狀蛋白成像。三次諧波產(chǎn)生則出現(xiàn)在折射率失配的界面或材料不均勻區(qū)域，可對細(xì)胞膜、富含脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞器邊界進(jìn)行細(xì)致的可視化呈現(xiàn)。通過整合這些非線性成像模式，研究者能夠從生物樣本中提取豐富的多維信息，深入理解細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。
短脈沖激光器提升三光子效率
由于多光子激發(fā)效率強(qiáng)烈依賴于脈沖期間入射光的峰值功率，脈沖越短，峰值功率越高，產(chǎn)生的多光子信號(hào)越強(qiáng)。迄今為止，產(chǎn)生80 fs以下超短且純凈脈沖的能力相對有限。
VALO飛秒系列激光器提供了一種突破該限制的新途徑，可獲得更短（低于50 fs）且純凈的脈沖。多光子事件效率與激光峰值功率呈非線性關(guān)系：雙光子和三光子過程的信號(hào)分別隨入射光峰值功率的平方和立方增長。例如，將脈沖持續(xù)時(shí)間從200 fs縮短至50 fs，峰值功率提高4倍，雙光子效率提升至4倍，三光子效率提升至16倍。
飛秒脈沖的另一優(yōu)勢在于提高雙光子熒光效率。高峰值功率增強(qiáng)了非線性相互作用，從而提高熒光效率，使研究者用更少的光子即可獲得高分辨率圖像，降低了對高激光功率的需求，并減少光損傷。此外，短脈沖持續(xù)時(shí)間與高峰值功率相結(jié)合，可在三維空間實(shí)現(xiàn)高分辨率成像，支持細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的研究。
簡言之，更短的激光脈沖意味著更高的峰值強(qiáng)度，可顯著增強(qiáng)成像信號(hào)：雙光子效率（2PE）信號(hào)隨脈沖縮短可增至5倍，三光子效率（3PE）信號(hào)最高可增至25倍。這些增益不僅改善圖像質(zhì)量，還減少熱量產(chǎn)生和光漂白，使活細(xì)胞長期成像更安全、穩(wěn)定。
亞50 fs脈沖對三光子成像的重要性
為從實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證短脈沖的優(yōu)勢，需要在樣本處準(zhǔn)確測量脈沖持續(xù)時(shí)間。若顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)缺乏適當(dāng)?shù)纳⒀a(bǔ)償，脈沖會(huì)展寬，導(dǎo)致焦點(diǎn)處峰值功率下降，從而削弱高階諧波產(chǎn)生的效率，使實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不可靠。
要在保持適合活體樣本的溫和平均功率的同時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)非線性信號(hào)（如SHG和THG），亞50 fs脈沖與有效的色散預(yù)補(bǔ)償缺一不可。這些條件可確保足夠的信噪比，同時(shí)不損害樣本完整性。
實(shí)驗(yàn)對比顯示：使用VALO飛秒系列激光器全帶寬（約40 fs脈沖）、樣品上平均功率4.7 mW時(shí)，校準(zhǔn)網(wǎng)格可產(chǎn)生清晰的三次諧波信號(hào)；而當(dāng)光譜帶寬限制在1064 nm附近10 nm（約160 fs脈沖）時(shí)，即使平均功率提高至6 mW，仍無法在實(shí)驗(yàn)噪聲本底之上直接獲得THG圖像，需將信號(hào)重新標(biāo)定放大方可成像。要獲得與亞50 fs短脈沖相當(dāng)?shù)男旁氡龋L脈沖需要約2.5倍的激光平均功率。
超快激光器支持高階非線性成像
與傳統(tǒng)飛秒激光系統(tǒng)相比，VALO超短脈沖激光器可產(chǎn)生寬達(dá)1140 nm的更寬光譜，深入近紅外波段。更寬的帶寬不僅支持二次諧波產(chǎn)生和雙光子激發(fā)等過程，還能激發(fā)三光子激發(fā)和三次諧波產(chǎn)生等更復(fù)雜的非線性現(xiàn)象。
其原理在于：標(biāo)準(zhǔn)顯微物鏡的透過特性決定了THG信號(hào)須由1080 nm以上的波長產(chǎn)生方能有效透過物鏡被探測；而傳統(tǒng)約1 μm波長的激光產(chǎn)生的THG信號(hào)位于紫外波段，往往因波長過短而無法透過標(biāo)準(zhǔn)物鏡。因此，這類新型激光系統(tǒng)的超寬光譜帶寬支持2PE、SHG、THG和3PE的同時(shí)產(chǎn)生與探測。
多光子顯微鏡在癌癥實(shí)時(shí)診斷中的應(yīng)用
多光子顯微鏡頗具前景的應(yīng)用方向之一是癌癥研究，尤其是癌癥診斷。傳統(tǒng)活檢分析可能需要數(shù)天，而高階諧波產(chǎn)生（HHG）成像可在數(shù)分鐘內(nèi)給出結(jié)果。近期一項(xiàng)研究表明，活檢組織在離體后僅六分鐘即可完成成像與分析，準(zhǔn)確率為87%。
該技術(shù)在支氣管鏡檢查等獲取足量診斷組織較為困難的操作中尤具價(jià)值。HHG成像可提供即時(shí)反饋，有望減少重復(fù)操作的需求。源自阿姆斯特丹自由大學(xué)的初創(chuàng)企業(yè)Flash Pathology正在開發(fā)用于臨床的緊湊型HHG顯微鏡，其目標(biāo)是將近實(shí)時(shí)、無標(biāo)記的組織成像引入醫(yī)院。該集成VALO飛秒激光器的移動(dòng)式顯微鏡可直接運(yùn)至手術(shù)室使用。
結(jié)論
在多光子顯微鏡中采用超短飛秒脈沖具有多重優(yōu)勢，包括降低光損傷、提高效率、改善空間分辨率以及減少背景信號(hào)。尤其是低于50 fs的超短脈沖提供了顯著更高的脈沖峰值功率，可在更低的平均功率下獲得理想信噪比的圖像，進(jìn)而減少光漂白、延長細(xì)胞活性。這些優(yōu)勢使多光子顯微鏡成為生物樣本研究的重要工具，幫助研究者以較低光損傷獲取高分辨率圖像。
參考文獻(xiàn)
相關(guān)研究發(fā)表于Journal of Biomedical Optics（2006，脈沖持續(xù)時(shí)間對雙光子激發(fā)熒光與二次諧波產(chǎn)生的影響）、Scientific Reports（2018，壓縮飛秒脈沖持續(xù)時(shí)間對經(jīng)內(nèi)鏡雙光子激發(fā)神經(jīng)元組織的影響）及Photonics Views（2025，激光揭示細(xì)胞奧秘）等學(xué)術(shù)期刊。
相關(guān)產(chǎn)品
VALO飛秒系列為超快飛秒光纖激光器，脈沖持續(xù)時(shí)間低至30 fs，功率可達(dá)3 W，配有計(jì)算機(jī)控制的群速度色散預(yù)補(bǔ)償功能，適用于多光子顯微鏡、雙光子聚合和光遺傳學(xué)等應(yīng)用。
